共聚焦激光掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)是近十多年研制成的高光敏度、高分辨率的新型儀器。它以激光為光源,由共聚焦成像掃描系統、電子光學系統和微機圖像分析系統組成。光束經聚焦后落在樣品(組織厚片或細胞)不同深度的微小一點,并作移動掃描,通過電信號彩色顯像,可使樣品內任何一點的反射光形成的圖像,都被準確地接收下來并產生信號,傳遞到彩色顯示器上,再連接微機圖像分析系統進行分析處理。
1、共聚焦顯微鏡的工作原理
共聚焦系統的光源為離子激光器或HeNe激光器,光源發出的激光束通過照明針孔后成為點光源P。點光源P通過分束器進入高數值孔徑顯微物鏡的成像系統成像后,在部分透明的被測樣品內形成像點P。從像點P發出的散射光及反射光(波長為λ1)和其他熒光(波長λf>λ1),=,反方向經過物鏡和分光鏡后,入射到單點探測器。單點探測器由探測器和放置在探測器前的針孔組成,它可以減少探測器的有效面積。探測器一般使用的是光電倍增管或雪崩光電二極管,探測器接收到的電信號最后由計算機進行處理 。
①如果激光束聚焦點的直徑小于針孔的直徑,則P處的針孔可以去掉 。
②有些材料能自發熒光,有些材料則需要用合適的染料上色 。
2、共聚焦顯微鏡的分類
根據共聚焦點相對于標本的移動方式,目前共聚焦顯微鏡可分為3種 。
其中最簡單的是在透鏡系統的光軸上固定住一個射限制點,控制其不發生術射,同時移動標本(標本掃描);
另一類是多點掃描型,弧形燈發出的光東經一個轉動孔板精細定位,平行地進行掃描和檢測,也就是轉盤共聚焦顯微鏡;
最為常見的類型是單點掃描,即通過移動反射鏡或使用聲光偏轉儀使激光通過光柵進行偏轉。
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